除了基因敲除、堿基編輯，提升基因功能是否還有其他的全新路徑?中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院姜臨建與青島清原化合物有限公司李華榮、中科院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心朱健康、貴州大學(xué)宋寶安等研究人員開(kāi)展合作，報(bào)道了一種“基因敲高”的新策略。

研究人員表示，這項(xiàng)研究進(jìn)一步深化了對(duì)基因編輯工具的認(rèn)知和理解?；蚓庉媱?chuàng)制基因組結(jié)構(gòu)變異是以自然為師。“基因敲高”有望成為基因編輯技術(shù)在動(dòng)植物育種上應(yīng)用的新領(lǐng)域。

第三大應(yīng)用場(chǎng)景

以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)能夠在基因組上產(chǎn)生精準(zhǔn)突變，為動(dòng)植物育種提供了革命性工具。由于基因編輯的最終產(chǎn)品不含外源基因，并且也可以通過(guò)傳統(tǒng)誘變或自然突變獲得，因此基因編輯作物在很多國(guó)家被視為普通品種。在美國(guó)上市的高油酸大豆、在日本上市的高γ—氨基丁酸番茄等，都是基因編輯產(chǎn)品作為常規(guī)品種推廣的案例。

論文通訊作者姜臨建介紹，目前，通過(guò)基因編輯技術(shù)來(lái)精準(zhǔn)誘變基因的應(yīng)用主要集中在兩個(gè)場(chǎng)景：一是對(duì)基因敲除，這是目前基因編輯在育種方面最普遍的應(yīng)用。上述大豆和番茄就是基因敲除的兩個(gè)例子。二是對(duì)基因進(jìn)行點(diǎn)突變，即通過(guò)堿基編輯提升基因功能。已在美國(guó)推廣種植的抗ALS除草劑油菜就是通過(guò)堿基替換，使內(nèi)源ALS基因獲得了抗除草劑的新功能。隨著堿基編輯技術(shù)的快速發(fā)展，該領(lǐng)域的應(yīng)用正日益深入。

“鑒于大量的基因通過(guò)提升其表達(dá)量即可帶來(lái)性狀的改良，因此基因敲高(即上調(diào)基因表達(dá))是與基因敲除、堿基編輯提升基因功能并列的第三大應(yīng)用場(chǎng)景。”姜臨建說(shuō)。

上調(diào)基因表達(dá)的通用技術(shù)路線是在目標(biāo)基因附近插入調(diào)控元件，例如強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，從而提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平。但是，由于插入整合了人工DNA，在推廣應(yīng)用方面可能會(huì)面臨嚴(yán)格的監(jiān)管。很顯然，如果能夠在不插入人工DNA的前提下實(shí)現(xiàn)上調(diào)基因表達(dá)，將在推廣應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)。不過(guò)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為該技術(shù)路線很難實(shí)現(xiàn)。

“敲高”水稻內(nèi)源基因

由于轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)水稻PPO1和HPPD就能夠分別帶來(lái)對(duì)兩種專利除草劑(中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán))的抗性，該研究的核心問(wèn)題是，如何在不整合人工合成DNA(作為強(qiáng)啟動(dòng)子)的前提下，利用基因編輯技術(shù)大幅“敲高”這兩個(gè)基因的表達(dá)。

許多研究很早就發(fā)現(xiàn)，Cas9同時(shí)在一個(gè)基因的不同位置切割時(shí)，會(huì)造成刪除、倒位、重復(fù)等基因組結(jié)構(gòu)變異。研究團(tuán)隊(duì)突然意識(shí)到，只要在所要上調(diào)表達(dá)的目標(biāo)基因附近找到高表達(dá)基因并選擇恰當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)切割，就能夠創(chuàng)造出特定的結(jié)構(gòu)變異，將高表達(dá)基因的啟動(dòng)子與目標(biāo)基因相連接，形成新的基因表達(dá)模式，從而大幅“敲高”目標(biāo)基因的表達(dá)。

據(jù)此，研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)水稻轉(zhuǎn)錄組信息，分別在PPO1和HPPD附近找到了高表達(dá)基因CP12和Ubiquitin2，并采用相關(guān)設(shè)計(jì)，構(gòu)建了雙靶點(diǎn)CRISPR載體對(duì)水稻愈傷進(jìn)行了大規(guī)模轉(zhuǎn)化，成功在水稻植株中創(chuàng)制了兩種不同且可以穩(wěn)定遺傳的基因組結(jié)構(gòu)變異。

在被成功編輯的水稻植株中，CP12基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PPO1基因的表達(dá)，Ubiquitin2基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HPPD基因的表達(dá)，從而大幅“敲高”了水稻內(nèi)源PPO1和HPPD基因，使水稻植株表現(xiàn)出預(yù)期的抗除草劑性狀。

作者表示，抗除草劑品種配合高效的專利除草劑，有望為水稻田雜草防控提供更加高效的解決方案。

有望成為基因編輯技術(shù)新領(lǐng)域

長(zhǎng)期以來(lái)，Cas9一直被作為基因敲除工具，而點(diǎn)突變及上調(diào)基因表達(dá)通常需要插入人工DNA模板，這是對(duì)基因編輯工具的傳統(tǒng)認(rèn)知。

之前，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了“循環(huán)打靶”堿基編輯策略，通過(guò)雙靶點(diǎn)的“循環(huán)打靶”設(shè)計(jì)將Cas9變成了全功能的堿基編輯器。此次研究中，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了能夠上調(diào)基因表達(dá)的倒位、重復(fù)等基因組結(jié)構(gòu)變異，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的敲高。

姜臨建表示，這意味著無(wú)需人工DNA模板，Cas9不僅能夠敲除基因，還可以創(chuàng)制點(diǎn)突變和敲高基因，是名副其實(shí)的全功能基因及基因組編輯工具。該研究進(jìn)一步深化了對(duì)基因編輯工具的認(rèn)知和理解。

隨著長(zhǎng)片段測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在基因組層面上比較不同品種之間的差異成為可能，“泛基因組學(xué)”方興未艾。大量泛基因組學(xué)研究表明不同品種之間存在大量結(jié)構(gòu)變異。一些重要的農(nóng)藝性狀就是基因組結(jié)構(gòu)變異的結(jié)果。例如，蟠桃和圓桃之間的果型差異是由桃基因組上大片段的倒位導(dǎo)致的;水稻基因組上特定片段的重復(fù)能夠影響秈粳雜交稻的育性。

由此，作者認(rèn)為，基因組結(jié)構(gòu)變異是物種演化的重要推動(dòng)力，是自然界中的普遍現(xiàn)象。通過(guò)基因編輯技術(shù)創(chuàng)制預(yù)期的結(jié)構(gòu)變異，是以自然為師而已。

改變基因的表達(dá)模式是動(dòng)植物遺傳改良的重要方面，但長(zhǎng)期以來(lái)主要依靠插入人工DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)研究提供了改變基因表達(dá)模式(尤其是敲高基因)的通用方法，不需要插入人工DNA，有望開(kāi)辟基因編輯技術(shù)在動(dòng)植物育種上應(yīng)用的新領(lǐng)域。(記者 王方 通訊員 何志勇)

標(biāo)簽： 師法自然 基因敲除 堿基編輯 基因功能